更新時間：2024-09-26
生物樣品掃描電鏡常規掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發性物質;具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發時能夠產生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數低，導電性差,激發后二次電子的產額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。
生物樣品掃描電鏡簡稱為掃描電鏡，英文縮寫SEM（Scanning Electron Microscope）。它是用細聚焦的電子束轟擊樣品表面，通過電子與樣品相互作用產生的二次電子、背散射電子等對樣品表面或斷口形貌進行觀察和分析。SEM已廣泛應用于材料、冶金、礦物、生物學領域。
通常人眼能夠分辨的最小距離為0.2MM，為了觀察分析更微小的細節，人們發明了各種觀察儀器。
首先出現的是光學顯微鏡，它利用可見光作為照明束照射樣品，再將照明束與樣品的作用結果由成像放大系統處理，構成適合人眼觀察的放大像。一般而言光學顯微鏡能分辨的最小距離約為200um，是人眼的一千倍。
為突破光學顯微鏡的分辨極限，人們想到用電子束做照明束，并與上個世紀三十年代制造出了第一臺掃描電子顯微鏡。它的分辨率已經達到了原子水平（≈0.1um），比光學顯微鏡提高了近兩千倍。
掃描電子顯微鏡組成部分
電子光學系統
組成：電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。
作用：獲得掃描電子束、作為產生物理信號的激發源。
信號收集和顯示系統
信號收集：二次電子和背散射電子收集器、吸收電子顯示器、X射線檢測器（波譜儀和能譜儀）
顯示系統：顯示屏有兩個，一個用于觀察，一個用于記錄照相。
掃描電子顯微鏡的應用
掃描電鏡觀察納米材料
所謂納米材料就是指組成材料的顆粒或微晶尺寸在0.1-100nm范圍內，掃描電鏡的一個重要特點就是具有很高的分辨率。現已廣泛用于觀察納米材料。
掃描電鏡觀察材料斷口
掃描電鏡所顯示的斷口形貌從深層次，高景深的角度呈現材料斷裂的本質，在教學、科研和生產中，有不可替代的作用，在材料斷裂原因的分析、事故原因的分析已經工藝合理性的判定等方面是一個強有力的手段。
掃描電鏡觀察大試樣的原始表面
掃描電鏡能夠直接觀察直徑100mm，高50mm，或更大尺寸的試樣，對試樣的形狀沒有任何限制，粗糙表面也能觀察，這便免除了制備樣品的麻煩，而且能真實觀察試樣本身物質成分不同的襯度(背反射電子象)。
生物樣品掃描電鏡常規掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發性物質;具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發時能夠產生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數低，導電性差,激發后二次電子的產額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。
電鏡是進行材料表征時用到一種重要工具，幫助觀察材料的微觀形貌。然而，在觀察軟/濕生物材料時(離體組織，帶細胞材料等)，涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟，處理復雜，耗時較長。
冷凍的水凝膠觀察
生物樣品掃描電鏡的構成：
樣品室：放置樣品，并安裝有各種信號探測器。
（2）信號收集及顯示系統：收集樣品在入射電子束作用下產生的各種信號，二次電子、背散射電子、特征X射線等，并進行放大轉換顯示在顯示系統上像。
（3）真空系統：場發射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度，所以配有2臺離子泵，1臺分子泵和一臺機械抽空泵。
（4）電源系統：包括啟動的各種電源，檢測-放大系統，真空系統和成像系統等。
分辨率的下降，掃描樣品在干燥過程中，由于失去水分會造成組織和細胞結構發生皺縮。此外，液體巨大的表面張力，將對細胞超微結構產生嚴重的影響。因此，生物樣品的干燥是掃描制備中的關鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導電性和較高的二次電子發射率
生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質量與樣品受激發產生的二次電子的多少有很大的關系。對于一幅由10°個像素組成的圖像，生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個掃描點上要產生平均6個二次電子，對于生物樣品，一般只能產生0.1~2個二次電子，使得圖像的質量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導電性較差，入射電子在樣品表面堆積，容易形成充放電現象，造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯位等反常圖像。因此，提高樣品的導電性、消除充放電效應和增強二次電子發射率是生物樣品掃描制備的另一個基本要求。
低真空下電鏡觀察葉子氣孔
樣品觀察表面必須保持其在活休狀態時的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質等雜質。此外，取樣時避免機械損傷。
含水的生物樣品在真空條件下極易揮發，因此，在掃描觀察時樣品必須干燥，以防水分的蒸發影響儀器的真空度
2.在樣品制備的過程中應始終保持樣品濕潤，切勿讓樣品干裂；
3.由于掃描電鏡觀察樣品表面，因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質；
4.較大樣品需將樣品切成片狀，厚度不超過2-3mm。
選取觀察材料需根據材料的特性與觀察目的的不同，采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動作迅速;取材部位準確;固定及時;避免機械損傷。體積的大小沒有太大的限制，觀察表面的面積通常不超過10mm×10mm，厚度約兒個毫米。對于一些微小的單體材料（如游離細胞、細菌、線蟲等)，取樣時應注意材料數量要取夠，防止在制備過程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。
用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質等，可使樣品表面充分暴露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過程中要避免對樣品表面細微結構損傷。清洗的具體做法可根據研究l的、樣品性質和樣品對環境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。
固定劑的種類、配制方法、固定時間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。
掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水，為了使樣品在干燥過程中，避免樣品中水分直接蒸發時產生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時達46000kg/cm3),使樣品結構遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮，采用等梯度系列脫水的方法，脫水時間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過2~3次。
螨蟲自然風干電鏡直接觀察
2、如果需要研究樣品表面的形態結構,如細胞的外形、細胞的生長形態等,則應選擇掃描電鏡觀察
生物樣品取材、固定、保存
1) “快速”：指盡量在活體條件下取材或動物斷血后2分鐘內取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(不可用酒精或消毒級戊二醛固定),并于4℃冰箱內保存,切忌樣品結冰。
2) “準確”：指取材部位要準確。取材的器械要鋒利,盡量減少對組織的牽拉和擠壓。
3) “體積小、低溫”：指組織厚度不應大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進行操作。
1) 取材時還應盡量保護觀察面,避免用鑷子夾持觀察區域,在固定前,通常應用適當的清洗液清洗樣品表面的雜質,灰塵,粘液等附著物。
2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。
3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內固定,保存在4℃冰箱中，切忌樣品結冰。
流程
取樣——3.5%戊二醛前固定；1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區定位——修塊——超薄切片機切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報告
1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察（冷凍電鏡）
2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察（常規檢測）
3) 取材——清洗——固定——組織導電處理——脫水——SEM觀察（特殊樣品，例如外泌體）
